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让多肽在活细胞里“按需”原位组装

针对这一难题，南开大学余志林研究员、‌史林启教授合作，提出通过将刺激响应非天然氨基酸引入bola两亲性多肽，利用可预测的氨基酸反应调节多肽非共价相互作用，并以谷胱甘肽响应和硫酸酯酶响应为代表，建立活细胞原位多肽组装系统。方案涵盖多肽设计与合成、刺激响应性表征、溶液及巨噬细胞、HeLa细胞和4T1细胞中的组装条件，以及荷4T1乳腺癌BALB/c小鼠中的亚细胞靶向和治疗应用；完成该方案需要多肽化学、材料工程和生物医学工程专业知识，预计92–115天。其核心思路是让多肽前体先以较小尺寸高效进入细胞，再在靶部位由刺激触发组装，从而兼顾内化效率与局部起效。相关论文以“In situ assembly of peptides in living cells”为题，发表在Nature Protocols上。

该方案将活细胞原位多肽组装拆分为多肽前体设计、合成与纯化、刺激响应性验证、溶液组装、活细胞原位组装和治疗应用六个阶段，并通过将刺激响应非天然氨基酸引入bola两亲性基序、利用氧化还原剂或酶触发组装，形成可在目标细胞和细胞器精准构建纳米结构的方法框架，为应对预组装多肽的脱靶效应和穿透不足提供了精确高效路径（图1）。

图1：由刺激响应非天然氨基酸调控的多肽原位组装用于癌症治疗的示意图。在本方案中，组装多肽前体通过将刺激响应非天然氨基酸引入bola两亲性基序而理性设计。经固相多肽合成后，在溶液和活细胞中表征刺激响应自组装。该系统能够原位形成亚细胞靶向组装体，并在生物医学应用中展现巨大潜力。图由MedPeer创建。

在溶液层面，研究以PMSeO为代表，用UPLC监测谷胱甘肽将其快速还原为PMSe（图2a），并验证过氧化氢可将其氧化回PMSeO（图2a）；尼罗红法估计PMSe的临界聚集浓度约为7.79 μM（图2b），圆二色谱显示前体呈无规卷曲、组装单体呈β-折叠（图2c），原子力显微镜和透射电镜则观察到纳米颗粒向纳米带的形貌转化（图2d-g），表明谷胱甘肽触发还原后可恢复多肽组装能力。

图2：多肽PMSeO的谷胱甘肽响应组装。a，PMSeO（0.5 mM）单独处理、经GSH（1.25 mM）处理以及经GSH（1.25 mM）和H2O2（2.5 mM）连续处理后的UPLC曲线。PMSeO经GSH处理2小时后被还原为多肽PMSe（蓝色曲线），而PMSe与H2O2孵育15分钟后完全转化为PMSeO（红色曲线）。b，通过绘制尼罗红最大发射波长随PMSe浓度的变化估计多肽PMSe的临界聚集浓度。c，PMSeO和PMSe在pH 7.4水中浓度为0.5 mM时的圆二色谱。d、e，浓度为0.5 mM的PMSeO（d）和PMSe（e）的原子力显微镜图像。f、g，浓度为0.5 mM的PMSeO（f）和PMSe（g）的透射电镜图像。透射电镜样品用2%（w/v）醋酸铀酰染色。h，PMSeO（0.5 mM）经GSH（1.25 mM）处理2小时后的原子力显微镜图像。

进一步以EVMSeO为对象，研究同样通过UPLC确认谷胱甘肽处理可将其转化为EVMSe（图3a），尼罗红法估计EVMSe的临界聚集浓度约为10.25 μM（图3b），圆二色谱、原子力显微镜和透射电镜显示刺激前后构象与形貌发生转变（图3c-g），且在浓度低于临界聚集浓度时EVMSeO以单体状态存在（图3d,f），说明谷胱甘肽响应可有效调控该多肽的组装行为。

图3：多肽EVMSeO的谷胱甘肽响应组装。a，EVMSeO（0.5 mM）在无或有GSH（10 mM）存在下的UPLC曲线，其中以EVMSe（0.5 mM）作为参考样品。b，通过绘制尼罗红最大发射波长随EVMSe浓度的变化估计多肽EVMSe的临界聚集浓度。c，EVMSeO和EVMSe在pH 7.4水中浓度为0.5 mM时的圆二色谱。d、e，浓度为0.5 mM的EVMSeO（d）和EVMSe（e）的原子力显微镜图像。f、g，浓度为0.5 mM的EVMSeO（f）和EVMSe（g）的透射电镜图像。透射电镜样品用2%（w/v）醋酸铀酰染色。h，EVMSeO（0.5 mM）经GSH（10 mM）处理24小时后的原子力显微镜图像。

在酶响应体系上，研究用UPLC追踪EIYs在硫酸酯酶处理0、10和90分钟后的转化，观察到含一个Ys单元的水解中间体（图4a）；EIY的临界聚集浓度估计为13.8 μM（图4b），圆二色谱显示EIYs与EIY的构象差异（图4c），原子力显微镜和透射电镜显示前体呈颗粒、组装单体呈纳米带或纳米纤维（图4d-g），硫酸酯酶处理24小时后形成纳米纤维（图4h），表明硫酸酯酶水解可触发多肽形貌转化。

图4：EIYs的硫酸酯酶响应组装。a，EIYs（0.2 mM）在乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中于37℃经硫酸酯酶（25 U/mL）处理0、10和90分钟后的UPLC曲线，其中观察到含一个Ys单元的水解中间体。b，通过绘制尼罗红最大发射波长随EIY浓度的变化估计EIY的临界聚集浓度。c，EIYs和EIY在pH 7.4水中浓度为0.1 mM时的圆二色谱。d、e，EIYs（0.5 mM）（d）和EIY（0.1 mM）（e）的原子力显微镜图像。f、g，EIYs（1 mM）（f）和EIY（0.2 mM）（g）的透射电镜图像。h，EIYs（0.2 mM）在乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中于37℃经硫酸酯酶（25 U/mL）处理24小时后的透射电镜图像。透射电镜样品用2%（w/v）醋酸铀酰染色。

在确认溶液响应后，研究转入细胞层面，以LPS刺激的巨噬细胞考察PMSeO的线粒体靶向原位组装：MTT实验显示细胞活力保持较高水平（图5a），流式细胞术显示含TAMRA标记肽的PMSeO被高效摄取且随时间增强（图5b,c），共聚焦激光扫描显微镜显示其与线粒体追踪剂共定位（图5d），透射电镜观察到线粒体周围形成短而刚性的纳米带（图5e），表明PMSeO可高效内化并在线粒体附近原位组装。

图5：刺激巨噬细胞中PMSeO的线粒体靶向原位组装。a，LPS刺激的巨噬细胞与0-250 μM PMSeO孵育48小时后的细胞活力。b、c，刺激巨噬细胞与含2% TAMRA标记肽的PMSeO（0.2 mM）孵育不同时间后的流式细胞术分析（b）和定量平均荧光强度（c）。a和c中数据以平均值±标准差表示（n=3次独立实验）。d，刺激巨噬细胞与含2% TAMRA标记肽的PMSeO（0.2 mM）孵育8或12小时后的代表性共聚焦激光扫描显微镜图像。e，刺激巨噬细胞与0.2 mM PMSeO孵育8小时后的透射电镜图像。e中蓝色方框表示围绕完整线粒体的放大区域。红色箭头指示LPS刺激巨噬细胞内形成的纳米带。

随后，研究在HeLa细胞中考察ER-EVMSeO的内质网靶向组装：圆二色谱显示谷胱甘肽还原前后的构象变化（图6a），原子力显微镜和透射电镜显示多肽由纳米颗粒向纳米带转化（图6b-e），MTT评估细胞活力（图6f），流式细胞术显示其被细胞摄取（图6g,h），共聚焦激光扫描显微镜显示其与内质网追踪剂共定位（图6i），结构光照明显微镜进一步观察到细胞内刚性纳米结构（图6j），表明该体系可实现内质网靶向的原位组装。

图6：HeLa细胞中ER-EVMSeO的内质网靶向原位组装。a，ER-EVMSeO（0.5 mM）在10 mM谷胱甘肽还原24小时前后的圆二色谱。b、c，浓度为0.5 mM的ER-EVMSeO（b）和ER-EVMSe（c）的原子力显微镜图像。d、e，浓度为0.5 mM的ER-EVMSeO在10 mM谷胱甘肽还原24小时前（d）和后（e）的透射电镜图像。透射电镜样品用2%（w/v）醋酸铀酰染色。f，HeLa细胞与不同浓度ER-EVMSeO孵育24小时后的细胞活力。g、h，HeLa细胞与含1% TAMRA标记肽的ER-EVMSeO（0.5 mM）孵育不同时间后的流式细胞术分析（g）和定量平均荧光强度（h）。g和h中数据以平均值±标准差表示（n=3次独立实验）。i，HeLa细胞与含1% TAMRA标记肽的ER-EVMSeO（0.5 mM）孵育4和8小时后的共聚焦激光扫描显微镜图像。j，HeLa细胞与含0.2% TAMRA标记肽的ER-EVMSeO（0.5 mM）孵育24小时后的结构光照明显微镜图像。共聚焦激光扫描显微镜分别使用405 nm和561 nm通道观察DAPI和TAMRA。

在蛋白靶向体系中，研究在4T1细胞中考察EIYsBE3与EIYBE3：圆二色谱比较EIYsBE3与EIYBE3的构象（图7a），原子力显微镜和透射电镜展示EIYBE3的形貌（图7b-f），微量热泳动实验显示EIYBE3与Bcl-xL和VHL的结合常数分别约为3.09和4.19 μM（图7g），MTT评估细胞活力（图7h），流式细胞术显示EIYsBE3的细胞摄取（图7i,j），共聚焦激光扫描显微镜显示EIYsBE3与溶酶体追踪剂共定位（图7k），透射电镜观察到细胞质内束状纳米纤维（图7l），表明EIYsBE3可被4T1细胞摄取、经溶酶体捕获并原位形成纳米纤维。

图7：4T1细胞中EIYsBE3的蛋白靶向原位组装。a，浓度为0.1 mM的EIYsBE3和EIYBE3的圆二色谱。b、c，EIYBE3（0.5 mM）（b）和EIYBE3（0.1 mM）（c）的原子力显微镜图像。d-f，EIYBE3（1 mM）（d）、EIYBE3（0.2 mM）（e）和EIYBE3（0.2 mM）在乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中于37℃经硫酸酯酶处理24小时（f）的透射电镜图像。透射电镜样品用2%（w/v）醋酸铀酰染色。g，EIYBE3与蛋白Bcl-xL或VHL的结合过程随配体L1或L2浓度变化的微量热泳动实验。h，4T1细胞与不同浓度EIYsBE3孵育24小时后的细胞活力。i、j，4T1细胞与含4% TAMRA标记肽的EIYsBE3（0.1 mM）孵育不同时间后的流式细胞术分析（i）和定量平均荧光强度（j）。g、h和j中数据以平均值±标准差表示（n=3次独立实验）。k，4T1细胞在EIYsBE3（0.1 mM）存在下孵育4和8小时后的共聚焦激光扫描显微镜图像。l，4T1细胞与EIYsBE3（0.2 mM）孵育12小时后的透射电镜图像。红色箭头指示原位形成的纳米纤维。

最终，研究将EIYsBE3原位组装用于癌症治疗：流式细胞术显示其诱导4T1细胞凋亡（图8a），蛋白质印迹显示其促进Bcl-xL降解，而抑制硫酸酯酶或VHL的预处理可挽救该效应（图8b）；体内荧光成像显示肿瘤积聚和离体器官分布（图8c），冷冻肿瘤切片共聚焦激光扫描显微镜观察到瘤内纳米纤维网络（图8d,e），肿瘤生长曲线显示其显著抑制肿瘤生长（图8f），表明Supra-PROTAC可在肿瘤部位原位组装、精准激活并促进靶蛋白降解，从而增强治疗效果。

图8：EIYsBE3原位组装为Supra-PROTAC用于癌症治疗。a，EIYsBE3（0.125 mM）处理24小时诱导4T1细胞凋亡率的流式细胞术分析。b，4T1细胞、ASL279预处理的4T1细胞和MG132预处理的4T1细胞经EIYsBE3（0.25 mM）处理24小时后，细胞内Bcl-xL水平的蛋白质印迹分析。EIYsBE3处理的4T1细胞所示泳道由同一原始印迹拼接而来，原始印迹见源数据。c，荷瘤小鼠给药EIYsBE3（2 mM）后不同时间的体内荧光图像，以及注射24小时后解剖器官和肿瘤的离体图像。d，给药EIYsBE3小鼠肿瘤组织冷冻切片的共聚焦激光扫描显微镜图像。e，给药小鼠肿瘤组织冷冻切片的高分辨率共聚焦激光扫描显微镜图像。f，给药EIYsBE3小鼠肿瘤组织生长曲线。统计分析采用单因素方差分析。***P<0.001。

总体而言，活细胞原位多肽组装从单体或纳米颗粒前体出发，在靶细胞和靶细胞器精准形成纳米结构，兼顾高效内化与局部起效，为克服预组装多肽脱靶和穿透不足提供了新方法。但该策略仍受多肽低内化、刺激源不足、刺激响应反应选择性差等因素制约；单体多肽降解要求快速组装，而非共价相互作用需精细调控，以避免过度稳定、不可逆的淀粉样纳米纤维积累；目前仍缺乏监测氨基酸反应和表征原位形成组装体的技术，离体表征与体内结构信息之间尚存差距，原位组装体的药代动力学、生物降解动力学和途径也了解有限。未来需扩展活细胞中精确操控多肽组装的工具箱，发展快速组装与可控非共价调控策略，桥接离体与体内结构信息，并加强药代与降解研究，以推动原位形成多肽组装体的临床转化。