蛋白质和RNA在细胞内的空间分布及其动态变化，是理解细胞功能的重要基础。APEX2邻近标记技术兼具快速标记和支持蛋白质与RNA分析的优势，已成为空间组学研究的重要工具。然而，自其发展以来的十余年间，对外加过氧化氢的依赖是限制其应用的关键瓶颈。过氧化氢带来的毒性与氧化应激不仅可能干扰细胞状态，也限制了APEX2在活体动物中的直接应用。如何摆脱对外加过氧化氢的依赖，同时保留APEX2的标记能力与现有工具体系，是推动该技术进一步发展的重要问题。

Hi-APEX的关键创新在于从标记底物入手，改变APEX2启动标记的条件。近日，清华大学药学院秦为副教授团队发现，带有四嗪基团的苯酚探针TP可在无需外加过氧化氢的条件下，由APEX2催化实现邻近标记。随后，通过四嗪与反式环辛烯之间的生物正交点击反应，将生物素标签连接至已标记的分子，即可进行富集及后续的质谱或RNA测序分析（图1）。这一设计使APEX2标记摆脱了对外加过氧化氢的依赖，从实验流程中省去了这一可能引入毒性和氧化应激的步骤，为研究氧化还原敏感过程和开展活体标记创造了条件。

这一突破同时具有便于应用的特点。Hi-APEX使用可商业获取的TP探针，无需进一步改造APEX2酶，也不需要额外的光照激活装置。研究人员能够沿用已有的APEX2表达载体和亚细胞靶向设计，调整标记及后续富集流程开展研究；已有的APEX2转基因动物模型也为衔接该方法提供了基础。因此，Hi-APEX不仅拓展了技术本身的适用范围，也为利用长期积累的APEX2研究资源开展活体空间组学分析提供了便捷路径。

图1.Hi-APEX与传统APEX标记流程示意图

研究团队在多个生物学场景中验证了Hi-APEX的应用。在亚细胞空间组学与分泌追踪方面，研究人员在线粒体基质中实现了蛋白质和RNA的富集，并将内质网腔定向标记与“脉冲—追踪”策略相结合，鉴定到728个经内质网途径分泌的蛋白质。在具有动态组装特征的应激颗粒研究中，团队在亚砷酸钠诱导的细胞模型中鉴定到186个高置信度应激颗粒蛋白质和155种富集RNA，并验证了SPDL1和CEP170向应激颗粒的募集。在对氧化还原状态敏感的铁死亡研究中，团队分析了mGPX4邻近蛋白质组成的变化，验证了mGPX4与TRMT61B的关联，并发现TRMT61B过表达使HT1080细胞对RSL3诱导的铁死亡更敏感。

研究进一步将Hi-APEX拓展至活体小鼠，在肿瘤移植模型中鉴定到228个高置信度mGPX4邻近蛋白（图2），并在海马神经元中完成线粒体基质蛋白质组分析。此外，Hi-APEX-seq在肿瘤移植模型中实现了线粒体RNA富集，鉴定到57种G3BP1邻近富集转录本，支持了该方法用于活体蛋白质和RNA空间分析的可行性。

图2.Hi-APEX用于活体小鼠肿瘤移植模型中的mGPX4邻近蛋白质组分析

总体而言，Hi-APEX通过更换化学探针，实现了无需外加过氧化氢的邻近标记，拓展了APEX2在应激响应、铁死亡和活体空间组学研究中的应用范围，为进一步探索相关生物学过程提供了方法支持。

10月29日，秦为团队与中国医学科学院药用植物研究所陈影研究员团队合作在《自然·化学生物》（Nature Chemical Biology）发表题为“基于不依赖过氧化氢的APEX2标记技术实现适用于活体的空间多组学”（In vivo-compatible spatial multi-omics via hydrogen peroxide-independent APEX2 labeling）的研究论文。该方法突破了APEX2长期依赖外加过氧化氢的技术瓶颈，同时兼容已有APEX2构建体，为衔接现有工具体系、推动空间组学研究从培养细胞走向活体动物提供了便捷路径。

秦为副教授与陈影研究员为论文共同通讯作者，清华大学药学院2024级博士生陈勃祎和2025届博士毕业生郭弘扬为论文共同第一作者。

本研究得到创新药物研发国家科技重大专项、国家自然科学基金、国家重点研发计划、中国医学科学院医学与健康科技创新工程、北京市自然科学基金、北京市科技新星计划、笃实计划、膜生物学全国重点实验室、清华医学神经退行性疾病专项和北京视觉科学与转化医学研究中心等项目与平台支持。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41589-026-02356-1

供稿：药学院

来源：北京号

作者: 清华大学